天然植物有效成分的提取新技術(shù)——復合生物酶解技術(shù)
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酶是生物體活細胞產(chǎn)生的，以蛋白質(zhì)形式存在的一類特殊的生物催化劑。某些酶可以在常溫、常壓和溫和的酸堿條件下，將植物細胞壁分解，較大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生產(chǎn)過程中的濾過速度和純化效果，提高產(chǎn)品純度和制劑的質(zhì)量。 生物酶解技術(shù)包括酶法提取(又稱酶反應提取)和酶法分離精制兩方面。該技術(shù)是在傳統(tǒng)的天然植物成分提取基礎(chǔ)上進行的，應用常規(guī)提取設備即可完成，操作簡便，成本低廉。 1原理 酶法提取是根據(jù)植物細胞壁的構(gòu)成，利用酶反應所具有高度專一性的特點，選擇相應的酶，將細胞壁的組成成分(纖維素、半纖維素和果膠質(zhì))水解或降解，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，使細胞內(nèi)的成分溶解、混懸或膠溶于溶劑中，從而達到提取目的，且有利于提高成分的提取率。許多天然植物中含有蛋白質(zhì)，采用煎煮法時蛋白質(zhì)遇熱凝同，影響提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以將天然植物中的蛋白質(zhì)分解析出，如此可提高成分的提取率。 天然植物水提液除了含有提取成分外，還含有淀粉、蛋白質(zhì)、果膠、樹膠、樹脂、黏液質(zhì)等，這些成分的存在往往使提取液呈混懸狀態(tài)，并影響提取液的濾過速度，為此要實施除雜，常用的方法有離心法、澄清劑法、醇沉法、大孔樹脂吸附法、離子交換法、微孑L濾膜濾過法及超濾法。而酶法除雜是分離精制的新方法，此方法是根據(jù)天然物提取液中雜質(zhì)的種類、性質(zhì)，有針對性地采用相應的酶，將這些雜質(zhì)分解或除去，以改善液體產(chǎn)品的澄清度，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。由于酶反應具有高度的專一性，決定了酶解方法除雜的高效性。 2酶的種類 2．1 用于天然植物細胞破壁的酶 2．1．1 纖維素酶 纖維素是由鏈狀結(jié)構(gòu)的β-D-葡萄糖以β- l，4-葡萄糖苷鍵結(jié)合而成的聚合物，纖維素分子束聚集成為較大的單位——微纖絲，構(gòu)成了植物細胞壁的框架，在微纖絲之間的空隙中尚有其他物質(zhì)(角質(zhì)、木質(zhì)素、二氧化硅)，形成植物細胞壁的基本結(jié)構(gòu)。在干燥植物中纖維素約占總重的l／3～l／2。 纖維素酶具有分解、軟化纖維素、破壞細胞壁、增加植物細胞內(nèi)容物的溶出量的作用，它是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3個組分。最適pH值4～5，最佳作用溫度40~60℃。 2．1．2半纖維素酶 半纖維素包括木聚糖、甘露聚糖、阿托伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多種組分，約占植物干重的35％。含量僅次于纖維素。 半纖維素酶由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶等內(nèi)切型酶，β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等組成。具有消化植物細胞壁的作用。 2．1．3果膠酶 果膠質(zhì)屬于黏液質(zhì)類，是植物細胞的正常產(chǎn)物，多見于植物的地下部分及種子中。 果膠酶是分解果膠質(zhì)的聚糖水解酶、果膠質(zhì)?；饷傅囊活悘秃厦傅目偡Q。固體的呈淺黃色，易溶于水；液體的呈棕褐色。最適作用溫度45-50 ℃，作用pH值3～6。 2．2用于分離精制、改善提取澄清度的酶 有木瓜蛋門酶、菠蘿蛋白酶、葡萄糖苷酶、轉(zhuǎn)糖苷酶。 3應 用 3．1酶法提取 3．1．1含生物堿類成分酶法提取 以黃連提取鹽酸小檗堿為例：將黃連粗粉按每g加入10 U量的纖維素酶(活力單位2 000 U·g-1)，充分混勻，加3倍量水，用0．3％硫酸調(diào)pH值至5后浸泡，在40℃下恒溫水浴90 min，將黃連及0．3％硫酸作溶劑置于滲漉筒中，浸漬、滲漉，收集滲漉液，用石灰乳調(diào)pH值至10～12，沉淀，抽濾，濾液用濃鹽酸調(diào)pH值至l～2，加精制食鹽使含鹽量達7％，充分攪拌，靜置24 h，濾過，i)l=淀，在60 ℃下干燥，得鹽酸小檗堿粗品。用薄層掃描法進行含量測定，結(jié)果表明：黃連經(jīng)酶法提取后，所得鹽酸小檗堿含量為4．2％，而未經(jīng)酶處理的鹽酸小檗堿含量平均為2．5％，兩種工藝樣品經(jīng)薄層層析鑒別，提取的成分一致。 3．1.2含黃酮類成分的酶法提取 以葛根提取總黃酬為例：將葛根粉碎成約l cm左右，用3倍水浸泡，加鹽酸調(diào)pH至4，加0．5％纖維素酶(活力單位約2 000 u·g-1)，充分攪拌，置40℃恒溫水浴中1．5 h，加5倍95％乙醇回流提取1 h，濾過，得第一次提取液備用；藥渣加5倍60％乙醇回流提取0．5 h，濾過，得第二次提取液；兩次提取液合并，回收乙醇，離心，取上清液，用正丁醇萃取3次，揮發(fā)盡正丁醇，得葛根總黃酮。用紫外分光光度法測定表明，葛根經(jīng)酶法提取后所得葛根總黃酮含量為8．68％，而未經(jīng)酶法提取的含量為7．68％。兩種T藝樣品經(jīng)薄層層析比較，成分一致。 3．1．3含香豆素成分的酶法提取 以補骨脂提取補骨脂素、異補骨脂素為例：每g補骨脂加入20U纖維素酶，用硫酸調(diào)pH值至4．5，充分攪拌，43 cC恒溫水浴3 h，放冷至室溫后，用0．1 tool·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至中性，加乙醇使浸泡液的含醇量達50％，體積為補骨脂的10倍，浸泡30 d。用薄層掃描法測定提取液中補骨脂素含量，結(jié)果補骨脂經(jīng)酶法提取的含量0．1814％，而未加酶提取的含量為O．1469％。 3．1．4含多糖類成分的酶法提取 以香菇提取香菇多糖為例：香菇的細胞壁由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和纖維素組成，結(jié)構(gòu)緊密，一般的提取方法因難以破壞其細胞壁，提取效果不理想。采用纖維素酶和菠蘿蛋白酶在香菇多糖的提取過程中進行酶解處理，可以大大提高可溶性同形物的提取效果；香菇提取液除去蛋白質(zhì)后用乙醇沉淀，得到6種多糖的混合物，測定其含量，兀酶處理的含32％，酶法提取的含50％左右。 此外，用纖維素酶處理穿心蓮提取穿心蓮內(nèi)酯；用OL--淀粉酶、OL--葡萄糖苷酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶處理銀杏葉提取黃酮類；用纖維素酶和蛋閂酶處理靈芝提取同形物等已應用于生產(chǎn)中。 3．2酶法分離精制 天然植物在采用常規(guī)提取的煎煮過程中，蛋門質(zhì)遇熱凝固體，淀粉糊化，影響有效成分的煎出，并給提取液的分離帶來困難。針對水提取液中所含的雜質(zhì)類型，采用相應的酶(木瓜蛋門酶分解蛋門質(zhì)、果膠酶分解果膠、淀粉酶分解淀粉)，將其降解為小分子物質(zhì)或分解除去，可改善水提取液的過濾困難問題，提高液體制劑的澄清度和制劑純度。 以決明子提取總蒽醌、青皮提取陳皮苷為例：決明子中加熱水少許，溫浸30 min，用10倍水煎煮2 h，再8倍水煎煮1．5 h，濾過，合并兩次濾液，濃縮至物料與藥液l：5，均分為5份，分別加入復合蛋白酶I(調(diào)節(jié)到60～70℃)、復合蛋白Ⅱ(55-60 ℃)、果膠酶(55-65℃)、澄清劑(50～60℃)、對照空白，保溫2 h，定時攪拌，離心(3 000 rpm)，過濾，將上清液和沉淀分別蒸干，結(jié)果用復合蛋白酶I處理效果較好，總蒽醌含量0．717％，而空白對照為0．223％。青皮的試驗，用果膠酶處理效果較好，陳皮苷含量6．26％，而空白對照為4．47％。 4技術(shù)關(guān)鍵 4．1酶的種類 采用酶法處理時，所用酶的種類應根據(jù)天然植物中的有效成分，輔助成分及物料的性質(zhì)來確定，不能一概而論。若采用復合酶，則復合酶的組成、比例也應篩選。關(guān)于酶的用量，需在含相同底物的提取液中加入不同量的酶進行酶解。通過測定酶解產(chǎn)物的含量，以確定最適用量。 4．2酶解溫度 在其他條件相同的情況下，將酶反應液分成若干份，分別控制在不同的溫度下進行酶解反應，測定酶反應的活性。以酶反應活性對溫度作圖，曲線上酶活性最高點所對應的溫度就是該反應的最適溫度，此時酶表現(xiàn)出最大的活性。若溫度超出該范圍，酶活性逐漸降低。 4．3酸堿度 酶反應需在一定pH值條件下進行，不同的天然植物使用酶的種類不同，酶解時的最佳pH值應根據(jù)試驗來確定。 4．4酶解時間 不同酶的最佳酶解時間需通過試驗確定。 4．5酶解工藝 采用酶反應法時，天然植物的粒度、浸泡時間、酶加入時間、攪拌速度等都影響酶解效果，需以目標成分含量、酶的活性、對藥效的影響、能否與其他方法聯(lián)用等指標進行綜合優(yōu)選
酶是生物體活細胞產(chǎn)生的，以蛋白質(zhì)形式存在的一類特殊的生物催化劑。某些酶可以在常溫、常壓和溫和的酸堿條件下，將植物細胞壁分解，較大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生產(chǎn)過程中的濾過速度和純化效果，提高產(chǎn)品純度和制劑的質(zhì)量。 生物酶解技術(shù)包括酶法提取(又稱酶反應提取)和酶法分離精制兩方面。該技術(shù)是在傳統(tǒng)的天然植物成分提取基礎(chǔ)上進行的，應用常規(guī)提取設備即可完成，操作簡便，成本低廉。 1原理 酶法提取是根據(jù)植物細胞壁的構(gòu)成，利用酶反應所具有高度專一性的特點，選擇相應的酶，將細胞壁的組成成分(纖維素、半纖維素和果膠質(zhì))水解或降解，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，使細胞內(nèi)的成分溶解、混懸或膠溶于溶劑中，從而達到提取目的，且有利于提高成分的提取率。許多天然植物中含有蛋白質(zhì)，采用煎煮法時蛋白質(zhì)遇熱凝同，影響提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以將天然植物中的蛋白質(zhì)分解析出，如此可提高成分的提取率。 天然植物水提液除了含有提取成分外，還含有淀粉、蛋白質(zhì)、果膠、樹膠、樹脂、黏液質(zhì)等，這些成分的存在往往使提取液呈混懸狀態(tài)，并影響提取液的濾過速度，為此要實施除雜，常用的方法有離心法、澄清劑法、醇沉法、大孔樹脂吸附法、離子交換法、微孑L濾膜濾過法及超濾法。而酶法除雜是分離精制的新方法，此方法是根據(jù)天然物提取液中雜質(zhì)的種類、性質(zhì)，有針對性地采用相應的酶，將這些雜質(zhì)分解或除去，以改善液體產(chǎn)品的澄清度，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性。由于酶反應具有高度的專一性，決定了酶解方法除雜的高效性。 2酶的種類 2．1 用于天然植物細胞破壁的酶 2．1．1 纖維素酶 纖維素是由鏈狀結(jié)構(gòu)的β-D-葡萄糖以β- l，4-葡萄糖苷鍵結(jié)合而成的聚合物，纖維素分子束聚集成為較大的單位——微纖絲，構(gòu)成了植物細胞壁的框架，在微纖絲之間的空隙中尚有其他物質(zhì)(角質(zhì)、木質(zhì)素、二氧化硅)，形成植物細胞壁的基本結(jié)構(gòu)。在干燥植物中纖維素約占總重的l／3～l／2。 纖維素酶具有分解、軟化纖維素、破壞細胞壁、增加植物細胞內(nèi)容物的溶出量的作用，它是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3個組分。最適pH值4～5，最佳作用溫度40~60℃。 2．1．2半纖維素酶 半纖維素包括木聚糖、甘露聚糖、阿托伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多種組分，約占植物干重的35％。含量僅次于纖維素。 半纖維素酶由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶等內(nèi)切型酶，β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等組成。具有消化植物細胞壁的作用。 2．1．3果膠酶 果膠質(zhì)屬于黏液質(zhì)類，是植物細胞的正常產(chǎn)物，多見于植物的地下部分及種子中。 果膠酶是分解果膠質(zhì)的聚糖水解酶、果膠質(zhì)?；饷傅囊活悘秃厦傅目偡Q。固體的呈淺黃色，易溶于水；液體的呈棕褐色。最適作用溫度45-50 ℃，作用pH值3～6。 2．2用于分離精制、改善提取澄清度的酶 有木瓜蛋門酶、菠蘿蛋白酶、葡萄糖苷酶、轉(zhuǎn)糖苷酶。 3應 用 3．1酶法提取 3．1．1含生物堿類成分酶法提取 以黃連提取鹽酸小檗堿為例：將黃連粗粉按每g加入10 U量的纖維素酶(活力單位2 000 U·g-1)，充分混勻，加3倍量水，用0．3％硫酸調(diào)pH值至5后浸泡，在40℃下恒溫水浴90 min，將黃連及0．3％硫酸作溶劑置于滲漉筒中，浸漬、滲漉，收集滲漉液，用石灰乳調(diào)pH值至10～12，沉淀，抽濾，濾液用濃鹽酸調(diào)pH值至l～2，加精制食鹽使含鹽量達7％，充分攪拌，靜置24 h，濾過，i)l=淀，在60 ℃下干燥，得鹽酸小檗堿粗品。用薄層掃描法進行含量測定，結(jié)果表明：黃連經(jīng)酶法提取后，所得鹽酸小檗堿含量為4．2％，而未經(jīng)酶處理的鹽酸小檗堿含量平均為2．5％，兩種工藝樣品經(jīng)薄層層析鑒別，提取的成分一致。 3．1.2含黃酮類成分的酶法提取 以葛根提取總黃酬為例：將葛根粉碎成約l cm左右，用3倍水浸泡，加鹽酸調(diào)pH至4，加0．5％纖維素酶(活力單位約2 000 u·g-1)，充分攪拌，置40℃恒溫水浴中1．5 h，加5倍95％乙醇回流提取1 h，濾過，得第一次提取液備用；藥渣加5倍60％乙醇回流提取0．5 h，濾過，得第二次提取液；兩次提取液合并，回收乙醇，離心，取上清液，用正丁醇萃取3次，揮發(fā)盡正丁醇，得葛根總黃酮。用紫外分光光度法測定表明，葛根經(jīng)酶法提取后所得葛根總黃酮含量為8．68％，而未經(jīng)酶法提取的含量為7．68％。兩種T藝樣品經(jīng)薄層層析比較，成分一致。 3．1．3含香豆素成分的酶法提取 以補骨脂提取補骨脂素、異補骨脂素為例：每g補骨脂加入20U纖維素酶，用硫酸調(diào)pH值至4．5，充分攪拌，43 cC恒溫水浴3 h，放冷至室溫后，用0．1 tool·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至中性，加乙醇使浸泡液的含醇量達50％，體積為補骨脂的10倍，浸泡30 d。用薄層掃描法測定提取液中補骨脂素含量，結(jié)果補骨脂經(jīng)酶法提取的含量0．1814％，而未加酶提取的含量為O．1469％。 3．1．4含多糖類成分的酶法提取 以香菇提取香菇多糖為例：香菇的細胞壁由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和纖維素組成，結(jié)構(gòu)緊密，一般的提取方法因難以破壞其細胞壁，提取效果不理想。采用纖維素酶和菠蘿蛋白酶在香菇多糖的提取過程中進行酶解處理，可以大大提高可溶性同形物的提取效果；香菇提取液除去蛋白質(zhì)后用乙醇沉淀，得到6種多糖的混合物，測定其含量，兀酶處理的含32％，酶法提取的含50％左右。 此外，用纖維素酶處理穿心蓮提取穿心蓮內(nèi)酯；用OL--淀粉酶、OL--葡萄糖苷酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶處理銀杏葉提取黃酮類；用纖維素酶和蛋閂酶處理靈芝提取同形物等已應用于生產(chǎn)中。 3．2酶法分離精制 天然植物在采用常規(guī)提取的煎煮過程中，蛋門質(zhì)遇熱凝固體，淀粉糊化，影響有效成分的煎出，并給提取液的分離帶來困難。針對水提取液中所含的雜質(zhì)類型，采用相應的酶(木瓜蛋門酶分解蛋門質(zhì)、果膠酶分解果膠、淀粉酶分解淀粉)，將其降解為小分子物質(zhì)或分解除去，可改善水提取液的過濾困難問題，提高液體制劑的澄清度和制劑純度。 以決明子提取總蒽醌、青皮提取陳皮苷為例：決明子中加熱水少許，溫浸30 min，用10倍水煎煮2 h，再8倍水煎煮1．5 h，濾過，合并兩次濾液，濃縮至物料與藥液l：5，均分為5份，分別加入復合蛋白酶I(調(diào)節(jié)到60～70℃)、復合蛋白Ⅱ(55-60 ℃)、果膠酶(55-65℃)、澄清劑(50～60℃)、對照空白，保溫2 h，定時攪拌，離心(3 000 rpm)，過濾，將上清液和沉淀分別蒸干，結(jié)果用復合蛋白酶I處理效果較好，總蒽醌含量0．717％，而空白對照為0．223％。青皮的試驗，用果膠酶處理效果較好，陳皮苷含量6．26％，而空白對照為4．47％。 4技術(shù)關(guān)鍵 4．1酶的種類 采用酶法處理時，所用酶的種類應根據(jù)天然植物中的有效成分，輔助成分及物料的性質(zhì)來確定，不能一概而論。若采用復合酶，則復合酶的組成、比例也應篩選。關(guān)于酶的用量，需在含相同底物的提取液中加入不同量的酶進行酶解。通過測定酶解產(chǎn)物的含量，以確定最適用量。 4．2酶解溫度 在其他條件相同的情況下，將酶反應液分成若干份，分別控制在不同的溫度下進行酶解反應，測定酶反應的活性。以酶反應活性對溫度作圖，曲線上酶活性最高點所對應的溫度就是該反應的最適溫度，此時酶表現(xiàn)出最大的活性。若溫度超出該范圍，酶活性逐漸降低。 4．3酸堿度 酶反應需在一定pH值條件下進行，不同的天然植物使用酶的種類不同，酶解時的最佳pH值應根據(jù)試驗來確定。 4．4酶解時間 不同酶的最佳酶解時間需通過試驗確定。 4．5酶解工藝 采用酶反應法時，天然植物的粒度、浸泡時間、酶加入時間、攪拌速度等都影響酶解效果，需以目標成分含量、酶的活性、對藥效的影響、能否與其他方法聯(lián)用等指標進行綜合優(yōu)選
